用于获得肉毒毒素的不含动物制品的培养基和方法
2020-01-06

用于获得肉毒毒素的不含动物制品的培养基和方法

用于发酵肉毒梭菌并获得可用于配制肉毒毒素药物组合物的肉毒毒素的培养基和方法。通过使用非动物来源制品替换动物来源制品,生长培养基中所含肉或乳品副产物的水平显著降低。使用的培养基优选为基本不含动物来源制品。

一般来讲,识别出了肉毒梭菌的四个生理组(I,II,III和IV)。能够产生血清上不同的毒素的生物体可来自一个以上的生理组。例如,B型和F型毒素可由来自组I或组II的菌株产生。另外,已经识别了可产生肉毒神经毒素的其他梭菌种类(巴氏梭菌(C.baratii),F型;丁酸梭菌(C.butyricum),E型;诺氏梭菌(C.novyi),C1或D型)的菌株。

因此,所附权利要求的精神和范围不应限制于以上提出的优选实施方案的叙述。

在另一个实施方案中,所述组合物包括基本不含动物来源制品、而是含有至少一种植物来源制品、还含有肉毒梭菌的培养基。本发明最后一个实施方案是一种组合物,所述组合物包括基本不含动物来源制品、而是含有至少一种大豆来源制品、还含有肉毒梭菌的

在本发明某一优选的实施方案中,培养肉毒梭菌和制备肉毒毒素的培养基可包括大豆来源制品以替换动物来源制品。或者,若不使用大豆来源制品,可使用脱苦味的羽扇豆(Lupinuscampestris)种子。已知羽扇豆种子中的蛋白含量与大豆极为接近。优选地,这些培养基包括经过水解可溶于水的大豆或羽扇豆来源的制品。然而,不溶性大豆或羽扇豆制品也可用于本发明中以替换动物制品。可被大豆或羽扇豆制品替换的常用动物来源制品包括牛心浸液(BHI)、动物来源的蛋白胨制品如细菌蛋白胨、水解的酪蛋白、以及乳品副产物如动物奶。

为了制备肉毒毒素,肉毒梭菌培养物可在用于接种发酵培养基的种子培养基中培养。根据在发酵阶段生产肉毒毒素的规模不同,涉及在种子培养基中培养的连续步骤数可以不同。然而,如前所述,在发酵阶段的培养可从贮存的培养物直接接种来进行。基于动物的培养肉毒梭菌的培养基通常包括ΜΠ、细菌蛋白胨、NaCl和葡萄糖。如前所述,可根据本发明制备另一种种子培养基,其中动物来源组分被非动物来源组分替换。例如但不限于,在培养肉毒梭菌和生产肉毒毒素的种子培养基中,大豆来源制品可替换BHI和细菌蛋白胨。优选地,大豆来源制品可溶于水,并且包含水解的大豆,尽管肉毒梭菌培养物可在含不溶性大豆的培养基中生长。然而,在可溶性大豆制品制成的培养基中,生长水平和随后的毒素产量均较高。

可以发现,种子培养基中Hy-Soy浓度为100g/L时可使随后的发酵步骤中毒素产生水平最高。另外,数据显示Hy-Soy种子培养基的种子步骤1在48小时后比24小时后可产生更好的生长状况。

肉毒梭菌类型的生理分组列于表1中。

40μ1的试验种子培养基培养物(不含动物制品)的小份可用于接种在8ml16XIOOmm试管中的各8ml对照或试验发酵培养基等份。然后在33士1°C下培育该培养物24小时。然后将试管在厌氧培养室中培育,以使细菌生长。各培养基实验可平行进行三次(即同一培养基包括三次独立的接种),还可包括未接种的对照,以在分光光度计中用作空白。每隔24小时使用Turner分光光度计(型号330)在660nm下测定生长状况(通过光密度OD值测定)。细胞溶解已经持续约48小时时停止培养,随后测定肉毒毒素的产量。

A型肉毒毒素在治疗多种临床症状中的成功引起了对其它肉毒毒素血清型的兴趣。因此,至少A、B、E和F型肉毒毒素已经在临床上用于人类。此外,纯(约150kDa)肉毒毒素已用于治疗人类。参见例如,KohlA.等,ComparisonoftheeffectofbotulinumtoxinA(Botox(R))withthehighly-purifiedneurotoxin(NT201)intheextensordigitorumbrevismuscletest,MovDisord2000;15(增补本3):165。因此,可使用纯(约150kDa)肉毒毒素制备药物组合物。

每2升制备的培养基中使用下列成分制备对照发酵培养基:BHI(500ml;这相当于大约45.5克干重牛心浸液),NZ-CaseTT(30g),以及基础培养基(至2升),ρΗ6·8。