Dig-3杀虫cry毒素
2020-01-08

Dig-3杀虫cry毒素

DIG-3Cry毒素、编码该毒素的多核苷酸、以及产生该毒素的转基因植物,可用于控制植物害虫。

应用载体特异性引物、W制备自所选择的±壤杆菌菌落的模板质粒DNA,通过PCR分析证实DIG-3基因插入物在二元植物转化载体中的存在。应用QiagenSpin⑥MiniPreps,根据生产商的说明,提取15mL在YEP(具有如前所述的大观霉素和链霉素)中生长的过夜培养物的4mL等分试样的细胞沉淀。来自在±壤杆菌电穿孔转化中使用的二元载体的质粒DNA被包含在内作为对照。应用来自Invitrogen的化qDNA聚合酶根据生产商的说明,W0.5X浓度完成PCR反应。在MJResearchPeltier热循环仪上进行PCR反应,所述热循环仪用W下条件设定程序:步骤1)94°3分钟;步骤2)94°45秒;步骤3)55°30秒;步骤4)72°1分钟Ab预期产物长度;步骤5)29次至步骤2;步骤6)72°10分钟。循环后在4°保持该反应。通过琼脂糖凝胶电泳(例如,0.7%至1%琼脂糖,w/v)分析扩增产物,并通过漠化乙锭染色显现。选择其PCR产物与质粒对照相同的菌落。

拟亩益整化。应用浸花法(Weigel和Glazebrook,2002)转化拟南芥(Ar油idopsisthaliana)Co^01。用所选择的±壤杆菌菌落接种1血至15血含有适当用于选择的抗生素的YEP肉汤的培养基。培养物在28°溫育过夜,W22化pm恒定揽拌。将每种培养物用于接种两个500mL的含有适当用于选择的抗生素的YEP肉汤培养基,新培养物在恒定揽拌下在28°溫育过夜。室溫下W约8700Xg沉淀细胞10分钟,弃去产生的上清液。将细胞沉淀轻轻地重悬于500mL含有W下物质的渗滤培养基中:l/2xMurashige和Skoog盐(Sigma-Al化ich)/GamborgB5维生素(GoldBioTechnology,St.Louis,M0)、10%(w/v)薦糖、0.044μΜ节氨基嚷岭(10μL/升的在DMSO中的Img/血储存液)和300μL/升SilwetL-77。将约1个月大的植物浸入该培养基中15秒,小屯、地确保浸没了最新的花序。侧放植物,并覆盖(透明或不透明)24小时,用水洗涂,并直立放置。使植物在22°、16小时光/8小时暗的光周期下生长。浸泡后约4周,收获种子。

(C)包含具有至多20个不会不利地影响由SEQIDNO:2编码的毒素的表达或活性的氨基酸取代、缺失或修饰的SEQIDNO:2的残基73至643的氨基酸序列的多肤。

包含编码天然或修饰形式的DIG-3蛋白、或其片段的核巧酸序列的DNA片段可通过商业供应商(例如,DM2.0,MenloPark,CA)合成,并作为标准质粒载体中的克隆片段提供,或可通过对其他含有合适核巧酸序列的构建体的标准分子生物学操作而获得。可鉴定DIG-3编码区内部的独特限制位点,并可合成包含DIG-3编码区的限制位点之间的序列的DNA片段,每一个此类片段编码特定的缺失、插入或其他DIG-3变化。可将编码经修饰的DIG-3片段的DM片段与其他DIG-3编码区片段或其他化y编码区片段在适当的限制位点处连接,W获得编码期望的全长DIG-3蛋白、缺失或变体DIG-3蛋白或融合蛋白的编码区。例如,可鉴定位于第一个DIG-3编码区开始处的合适的限制识别位点,W及该DIG-3编码区内部的第二限制位点。该第一DIG-3编码区在运些限制位点的切割会产生包含部分该第一DIG-3编码区的DNA片段。对另一DIG-3编码区或其他化y编码区特异性的、其两侧为类似坐落的相容限制位点的第二DNA片段可用于与该第一DNA限制片段组合,W构建变体或融合克隆。

[010引抗毒素抗体。可应用本领域的标准方法容易地制备针对本文公开的毒素、或针对运些毒素的等价毒素或片段的抗体。此类抗体可用于检测DIG-3毒素的存在。

在一些情况中,还可W进行非保守取代。关键因素是运些取代必须不显著减小该毒素的生物活性。变体包括由于诱变而在氨基酸序列上不同的多肤。本发明包含的变体蛋白是生物学活性的,即它们继续拥有天然蛋白的期望生物学活性,即保持杀虫活性。

[018引针对ECB和巧CB计算的LCs。和GI5。值,置信区间(讯为95%

发明详述

沈QIDNO:1编码全长DIG-3毒素的DNA序列;3771nt。